Curcumin-rich extract from Central Brazil Curcuma longa protects human umbilical vein endothelial cells under oxidative stress / Extrato rico em Curcumina do Brasil Central Curcuma longa protege células endoteliais de veias umbilicais humanas sob estresse oxidativo

INTRODUCTION: In vascular diseases, the interruption of the local blood flow and the subsequent reperfusion of oxygen can cause deleterious oxidative effects on the cells. Turmeric (Curcuma longa L.) presents the capacity to neutralize free radicals along with preventive and therapeutic effects for several diseases. OBJECTIVE: To analyze the bioactive compounds and the antioxidant capacity of the ethanolic extract of Curcuma (EEC), to evaluate its effect on human umbilical vein endothelial cells, and to analyze its effect on cellular signaling pathways. METHODS: Cells were exposed to different concentrations of EEC for 24, 48, and 72 h. Folin-Ciocalteau test, HPLC-Fluorescence analysis, and DPPH method were used to determine the phenolic compounds, curcumin content, and antioxidant action, respectively; the tetrazolium salt reduction to obtain cell viability, cytotoxicity, and the concentration that inhibits 50% of cell viability; and the immunocytochemistry technique to analyze the expression of caspase3, SIRT1, and mTOR. RESULTS: We found the presence of polyphenols in the classes of phenolic acids and curcuminoids in EEC, with 16.7% curcumin content. The number of antioxidants needed to reduce the initial DPPH concentration by 50% was 18.1 µmol/g. The extract mitigated cell damage at a dosage of 100 µg/ml, decreased the immunoexpression of caspase3, and promoted the signaling of the SIRT1 and mTOR survival pathways. CONCLUSION: EEC had a protective effect on human umbilical vein endothelial cells, subjected to oxidative stress, with decreased apoptosis (caspase3) at lower concentrations, cytoprotection by maintaining essential cell functions (mTOR), and signaling of the survival pathway (SIRT1).

INTRODUÇÃO: Em doenças vasculares, a interrupção do fluxo sanguíneo locale subsequente reperfusão de oxigênio pode causar efeitos deletérios e danos irreparáveis às células. Curcuma (Curcuma longa L.) neutraliza radicais livres além de apresentar efeitos preventivos e terapêuticos. OBJETIVO: Caracterizar os compostos bioativos e a capacidade antioxidante do extrato etanólico de cúrcuma (EEC); avaliar seu efeito nas células endoteliais da veia umbilical humana, e analisar a expressão de vias de sinalização celular. MÉTODOS: As células foram expostas a diferentes concentrações de EEC por 24, 48 e 72 horas. Utilizamos o teste de Folin-Ciocalteau, análise por HPLC-Fluorescência e método DPPH para determinar os compostos fenólicos, conteúdo de curcumina e ação antioxidante, respectivamente; o método de redução de tetrazólio para viabilidade celular, a citotoxicidade e a concentração que inibe 50% da viabilidade celular; e a técnica de imunocitoquímica para analisar a expressão de caspase3, SIRT1 e mTOR. RESULTADOS: Observou-se presença de polifenóis nas classes de ácidos fenólicos e curcuminóides no EEC, com teor de curcumina de 16,7%. A quantidade de antioxidante necessária para reduzir a concentração inicial de DPPH em 50% foi de 18,1 µmol/g. O extrato mitigou o dano celular na dosagem de 100 µg/ml, diminuiu a imunoexpressão da caspase3 e promoveu a sinalização das vias de sobrevivência SIRT1 e mTOR. CONCLUSÃO: O EEC teve efeito protetor nas células endoteliais de veia umbilical humana, submetidas ao estresse oxidativo, com diminuição da apoptose (caspase3) em concentrações mais baixas, citoproteção pela manutenção das funções celulares essenciais (mTOR) e sinalização da via de sobrevivência (SIRT1).

Effect of dietary inclusion of guanidinoacetic acid on broiler performance / Efecto de la inclusión dietética del ácido guanidinoacético en el desempeño de pollos de engorde / Efeito da inclusão dietética do ácido guanidinoacético no desempenho de frangos de corte

Abstract Background: Creatine and its precursor, guanidinoacetic acid (GAA), decrease protein degradation, avoiding amino acid offset to gluconeogenesis. Objective: To evaluate the inclusion of GAA in the pre-initial diet (1 to 7 days) on performance, digestibility, and blood parameters of broilers from one to 21 days of age. Methods: 252 male broiler chickens aged one day were distributed in a completely randomized design with seven replicates and 12 animals per experimental unit. Treatments consisted of a basal diet, and the basal added with 0.10 and 0.20% GAA. Results: From days 1 to 7, a tendency on improved feed conversion (FC) was observed for broilers receiving 0.20% GAA (p<0.10). Between 7 and 14 days, FC improved, as well as a tendency was observed on improved weight gain in animals fed 0.20% GAA. Animals that received 0.20% GAA showed higher blood concentrations of creatine kinase. Blood creatine and blood glucose did not differ between treatments at day six. The assimilation coefficient of crude protein increased during days 3 to 7 for animals receiving 0.20% GAA. On the period between 17 and 21 days, no difference was observed between treatments. Intestinal weight and length did not show significant differences. Conclusion: Dietary inclusion of 0.20% GAA during the pre-initial stage could improve weight gain and feed conversion of broilers between 1 and 14 days of age.

Resumen Antecedentes: La creatina suministra energía y el ácido guanidinoacético (GAA) es su precursor y actúa como sustrato energético, reduciendo la degradación proteica y evitando el desvío de aminoácidos para gluconeogénesis. Objetivo: Evaluar el GAA en la dieta de pre-iniciación (1 a 7 dias) sobre el desempeño, la digestibilidad y los parámetros sanguíneos de pollos entre 1 y 21 dias de edad. Métodos: Se utilizaron 252 pollitos de engorde machos de un día de edad, distribuidos en un diseño completamente al azar, con siete repeticiones y 12 aves por unidad experimental. Los tratamientos consistieron en: ración basal y ración basal adicionada con 0,10 y 0,20% de GAA. Resultados: En el período de 1 a 7 días se observó una tendencia de mejora de la conversión alimenticia (FC) en las aves que recibieron 0,20% de GAA (p<0,10). De 7 a 14 días hubo mejoría en FC y tendencia de mejora en ganancia de peso de los animales que recibieron 0,20% de GAA. Los animales que recibieron 0,20% de GAA presentaron mayor concentración sanguínea de creatina quinasa. La creatinina y la glucosa sanguínea a los seis días no difirieron entre los tratamientos. El coeficiente de metabolización de la proteína bruta aumentó en el período de 3 a 7 días en los animales que recibieron 0,20% de GAA. Para el período de 17 a 21 días no hubo diferencia entre los tratamientos. Para peso y longitud del intestino no se presentaron diferencias significativas. Conclusión: El GAA a un nivel de 0,20% en la dieta pre- inicial podria mejorar la ganancia de peso, y la conversión alimenticia en el período de 1 a 14 días de edad en pollos de engorde.

Resumo Antecedentes: A creatina é uma substância que fornece energia e o ácido guanidinoacético (GAA) é seu precursor atuando como substrato energético, menor degradação proteica evitando o desvio de aminoácidos para gliconeogênese. Objetivo: Avaliar o GAA em dietas pré-iniciais sobre o desempenho, a digestibilidade e parâmetros sanguíneos. Métodos: Foram utilizados 252 pintos de corte machos de um a 21 dias de idade distribuído sem delineamento inteiramente casualizado, sete repetições e 12 aves por unidade experimental. Os tratamentos consistiram: ração basal e rações com 0,10 e 0,20% de GAA. Resultados: No período de 1 a 7 dias foi observada tendência de melhora da conversão alimentar (FC) (p<0,10) quando as aves receberam 0,20% de GAA. No período de 7 a 14 dias houve melhora na FC e tendência de melhora do ganho de peso dos animais que receberam 0,20% de GAA. Animais que receberam 0,20% de GAA apresentaram concentração sanguínea da enzima creatina quinase maior. A creatinina sanguínea aos seis dias e glicose sanguínea não diferiram entre os tratamentos. O coeficiente de metabolização da proteína bruta foi aumentado no período de 3 a 7 dias para animais que receberam 0,20% de GAA, para o período de 17 a 21 dias não houve diferença entre os tratamentos. Peso e comprimento do intestino não apresentaram diferenças significativas. Conclusão: O GAA em nível de 0,20% na dieta pré-inicial melhoram o ganho de peso, e a conversão alimentar no período de 1 a 14 dias de idade em frangos.

Cytotoxicity assessment of beta-lapachone in endothelial cells

The selective activity of an antineoplastic drug is related to its ability to promote cytotoxic action on tumor cells and preserve the integrity of non-neoplastic cells. Beta-lapachone is extracted from the sawdust of Ipe wood, a thick bark tree from the Ipe wood found in the Brazilian Cerrado biome. This study aimed to evaluate the cytotoxic action of beta-lapachone in an endothelial cell line. The EA.hy926 cells were seeded in two groups, G1 and G2, cultured and exposed to beta-lapachone at concentrations of 0.0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 and 3 & 956;M for 24 hours. G1 remained under normal cultivation conditions and G2 was subjected to oxidative stress through an ischemia and reperfusion assay, in a deoxygenated sealed chamber. The cytotoxicity assay was performed using the tetrazolium reduction method. In G1, the cytotoxicity ranged from 0.0 to 10.0%; and in G2 between 0.0 and 6.3%. No statistically significant difference was observed between the obtained values. Moreover, we found no cytotoxic action of beta-lapachone on endothelial cells, and the results point out that the drug might have preserved the cell’s integrity against oxidative stress under the conditions of this experiment. This promising result suggests the possibility of beta-lapachone as a chemotherapy drug with selective activity.

Ethanolic extract of gabirobeira (Campomanesia adamantium) leaves reduces proliferation of osteosarcoma cells in vitro

Osteosarcoma is the most commonly diagnosed malignant bone tumor in humans, with a higher incidence in children and young people. It is highly aggressive and has a high metastatic potential. Its treatment is based on both chemotherapy and surgical intervention. However, currently used chemotherapeutic agents, such as doxorubicin, have several adverse effects on the patient. Therefore, there is a growing demand for new chemotherapeutic agents that stimulate new researches, such as those involving compounds extracted from plants, such as the gabirobeira. In this study, we aimed to evaluate the cytotoxic effects of ethanolic extract, both crude and ethyl acetate, of gabirobeira leaves on osteosarcoma cells in vitro. Cytotoxicity was evaluated using the Trypan blue exclusion method and the IC50 values were calculated using the tetrazolium reduction method. The ethanolic extract of gabirobeira leaves showed a cytotoxic effect on osteosarcoma cells in vitro. The group treated with the crude extract at 1. 0& 956;L mL-1 concentration for 48 hours showed higher cytotoxicity and the lowest IC50 value for this extract was found in the 24 to 48 hours interval. The ethanolic extract of gabirobeira leaves is cytotoxic for osteosarcoma cells.

Ozonized solutions favor the repair of experimentally induced skin wounds in rats / Soluções ozonizadas favorecem o reparo de feridas cutâneas experimentalmente induzidas em ratos

This study aimed to evaluate and compare the effects of ozonized solutions on tissue wound repair in rats. Treatments consisted of ozonized water (GA), 0.9% sodium chloride (GCL), ozonized oil (GO), and 0.2% allantoin cream (GAL). The morphometric evaluation showed that wounds of the GA group presented a higher degree of retraction (p<0.05) at three and eight days of treatment (37.96 and 84.81%, respectively). Picrosirius red staining showed that groups GA and GO presented higher deposition (p<0.05) of type I collagen at 15 and 22 days of treatment, respectively. The neovascularization was higher in wounds of group GO on days 3, 8, and 15 (p<0.05), with higher VEGF immunostaining. (p<0.05). Thus, ozonized water enhances wound retraction and assists in the maturation and remodeling phase, while ozonized oil promotes higher neovascularization during tissue repair and higher deposition of type I collagen from the third week of treatment.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar os efeitos de soluções ozonizadas sobre o reparo tecidual de feridas em ratos. Foram realizados os tratamentos: água ozonizada (GA), cloreto de sódio 0,9% (GCL), óleo ozonizado (GO) e creme de alantoína 0,2% (GAL). À avaliação morfométrica, as feridas do grupo GA apresentaram maior grau de retração (p<0,05) aos três e oito dias de tratamento (37,96% e 84,81%, respectivamente). A coloração de picrosirius red mostrou que os grupos GA e GO apresentaram maior deposição (p<0,05) de colágeno do tipo I aos 15 e aos 22 dias de tratamento, respectivamente. Já a variável neovascularização foi maior (p<0,05) nas feridas do grupo GO nos dias três, oito e 15, o que fora ratificado à imunoistoquímica, com maior imunomarcação de VEGF nas feridas do grupo GO (p<0,05). Conclui-se que a água ozonizada potencializa a retração da ferida e auxilia na fase de maturação e remodelamento, enquanto o óleo ozonizado promove maior neovascularização durante o reparo tecidual e maior deposição de colágeno do tipo I a partir da terceira semana de tratamento.(AU)

Correlation between clinical findings, mast cell count and interleukin 31 immunostaining in the skin of dogs with atopic dermatitis / Correlação entre achados clínicos, contagem de mastócitos e imunomarcação de interleucina 31 na pele de cães com dermatite atópica

ABSTRACT: In this study the correlation between the clinical score, mast cell count and interleukin 31 (IL-31) immunostaining in the skin of dogs with atopic dermatitis was determined. A total of 31 dogs of different breeds, from one to eight years of age, were chosen for the study. The 20 females and 11 males were categorized based on the CADESI-4 system, as having discrete, moderate or marked atopic dermatitis. Skin samples were collected from the axillary and interdigital regions and stained with hematoxylin and eosin for cytohistomorphological analyses and toluidine blue to evaluate the mast cell counts, and immunohistochemistry for the IL-31 immunostaining. Animals revealing higher atopic dermatitis scores had greater numbers of mast cells and IL-31 immunolabeled cells. More numbers of cells immunolabeled for IL-31 were evident in the axillary skin compared with the interdigital skin in dogs having this condition. A correlation was identified between the clinical scores and mast cell numbers in the interdigital region, as well as between the clinical scores and number of cells immunolabeled for IL-31 in the axillary area. A correlation was also reported between the mast cell numbers and IL-31 immunolabeled cells only in the axillary skin, and none in the interdigital regions. It was thus concluded that the mast cells and IL-31 are involved in the pathogenesis of the canine atopic dermatitis (CAD), as well as lymphocytes and plasma cells. It was also observed that the higher the degree of clinical severity of the disease, the more the numbers of mast cells and IL-31 in the skin of those animals suffering from CAD, which implies the influence of these immunological constituents on the genesis of pruritus and disease progression.

RESUMO: Este estudo avaliou a correlação entre o escore clínico, a contagem de mastócitos e a imunomarcação de interleucina 31 (IL-31) na pele de cães com dermatite atópica. Foram selecionados 31 cães de diferentes raças, com idade entre um e oito anos, sendo 20 fêmeas e 11 machos, divididos em discretamente, moderadamente e acentuadamente acometidos por dermatite atópica segundo o sistema CADESI-4. Amostras da pele das regiões axilar e interdigital foram colhidas e submetidas às colorações de hematoxilina e eosina para a avaliação cito-histomorfológica e azul de toluidina para a contagem de mastócitos, bem como a técnica de imunoistoquímica para a imunomarcação de IL-31. Os animais com maior escore de dermatite atópica apresentaram maior número de mastócitos e de células imunomarcadas para IL-31. Houve maior número de células imunomarcadas para IL-31 na pele da axila em relação à interdigital nos cães com a doença. Foi constatada correlação entre o escore clínico e a quantidade de mastócitos no interdígito, bem como entre o escore clínico e a quantidade de células imunomarcadas para IL-31 na axila. Também foi verificada correlação entre a quantidade de mastócitos e células imunomarcadas para IL-31 na pele da região axilar, mas não da interdigital. Conclui-se que mastócitos e a IL-31 estão envolvidos na patogenia da DAC, assim como linfócitos e plasmócitos. Também, quanto maior o grau de severidade clínica da doença, maior a quantidade de mastócitos e IL-31 na pele dos animais com DAC, o que remete à influência desses componentes imunológicos na gênese do prurido e progressão da doença.

Production and chemical composition of hybrid Brachiaria cv. Mulato II under a system of cuts and nitrogen fertilization / Produção e composição bromatológica da Brachiaria híbrida cv. Mulato II sob regime de cortes e adubação nitrogenada

The production capacity of green and dry mass of the entire plant, efficiency of N conversion, apparent N recovery and the chemical composition of cultivar Mulato II was evaluated under a system of cuts and nitrogen doses. The assay, conducted in the municipality of Goiânia, GO, Brazil, had a totally randomized 2 x 4 factorial design (2 height cuts, 0.40 and 0.50 m and 4 nitrogen doses), with three replications and subdivided subplots. Treatments comprised four N doses (0, 50, 100 and 150 kgha-1 N, with urea as nitrogen source). There was no significant interaction (p>0.05) between N doses and cut heights for the variables productivity of green (PGM) and dry (PDM) mass, nitrogen use efficiency (NUE) and apparent N recovery (ANR), which were neither affected (p<0.05) by N doses nor by evaluated cut heights. Average productivity reached 59,450 kgha-1 (PGV) and 10,367 kgha-1 (PDM) and it was produced an average of 19.62 kg of DM per kg of N, with a mean 56.00% recovery. N doses and cut heights did not affect (p>0.05) DM rates of the plant, whilst mean dry matter rate was 17.49%. CP rates were affected (p<0.05) by N doses (0, 50, 100 and 150 kgha-1) and cut heights (0.40 and 0.50 m) and by the interaction of these factors. CP rates of the entire plant hybrid Brachiaria cv. Mulato II increased (p<0.05) due to N doses through an increasing linear relationship. Since there was a significant effect (p<0.05) with regard to cut height and CP rates decreased with height increase. NDF rates were significantly influenced by N doses (p<0.05) and by cut heights (p<0.05), with significance for the interaction (p<0.05) of over 100 kgha-1 N doses only. No significant interaction (p>0.05) occurred in ADF rates among the variables analyzed. ADF contents were influenced by N supply (p<0.05) with decreasing quadratic regression as N doses increased.

O presente trabalho de pesquisa teve como objetivo avaliar o potencial produtivo de massa verde e seca da planta inteira, a eficiência de conversão do N, a recuperação aparente do N, bem como a composição bromatológica do cultivar Mulato II, sob regime de cortes e submetido a doses de nitrogênio, no município de Goiânia, GO, Brasil. Utilizou-se um delineamento experimental inteiramente casualizado com arranjo fatorial 2 X 4 (2 alturas de corte (0,40 e 0,50 m) X 4 doses de nitrogênio) com três repetições e parcelas subdivididas. Os tratamentos foram constituídos por quatro doses de N (0, 50, 100 e 150 kgha-1 de N) (sendo a fonte ureia). Não ocorreu interação significativa (p>0,05) entre doses de N e alturas de corte para as variáveis produtividades de massa verde (PMV) e massa seca (PMS), eficiência de conversão aparente de nitrogênio (ECAN) e recuperação aparente de nitrogênio (RAN), que não foram influenciadas (p<0,05) pelas doses de N, nem em função das alturas de corte avaliadas. A média de produtividade encontrada foi de 59.450 kgha-1 (PMV) e 10.367 kgha-1 (PMS), produzindo em média 19,62 kg de MS para cada kg de N aplicado, com uma recuperação média de 56,00%. As doses de N aplicadas e as alturas de corte não influenciaram (p>0,05) os teores de MS da planta. A média do teor de matéria seca encontrada foi de 17,49%. Os teores de PB foram influenciados (p<0,05) pelas doses de N (0, 50, 100 e 150 kgha-1) e alturas de corte (0,40 e 0,50 m) bem como a interação desses fatores. Os teores de proteína bruta (PB) da planta inteira Brachiaria híbrida cv. Mulato II aumentaram (p<0,05) em função das doses de N, apresentando uma relação linear crescente. Quanto à altura de corte, ocorreu também efeito significativo (p<0,05), evidenciando que os teores de PB diminuíram com o aumento da altura. Os teores de FDN foram influenciados significativamente pelas doses de N (p<0,05) e pelas alturas de corte (p<0,05), apresentando significância para a interação (p<0,05) apenas nas doses acima de 100 kgha-1 de N. Para os teores de FDA não houve interação significativa (p>0,05) entre as variáveis analisadas. O conteúdo de FDA foi influenciado pelo fornecimento de N (p<0,05), apresentando regressão quadrática decrescente com o aumento das doses de N.

Phenotypic and molecular detection of Salmonella sp. on growing, rearing and production phases in a commercial group of laying hens / Detecção fenotípica e molecular de Salmonella sp. nas fases de cria, recria e produção em lote de poedeiras comerciais

This present study was developed with the objective of detect Salmonella sp. by conventional bacteriology and qPCR techniques in samples of flooring material from transport crates (meconium); raising environment (swab of cages and drinking fountains); cloacal swab; food and insects from growing, rearing and production phases in a commercial group of laying hens. A total of 864 samples were collected, among whom 248 originated from growing, 392 from rearing and 224 from production phase. Among the 864 samples, 2,8% where positives in bacteriologic technique and 15.3% in qPCR. Contamination was higher in growing and rearing phases and declined in production phase. Twenty four isolations of Salmonella where typified as Salmonella Agona (41.7%), Salmonella Livingstone (33.3%), Salmonella Cerro (16.7%), Salmonella Senftenberg (4.2%) and Salmonella Schwarzengrund (4.2%). During growing phase Salmonella Livingstone was identified. These findings suggest vertical contamination in the group. During rearing and production phases, isolated materials belong to serovars Agona, Cerro, Senftenberg and Schwarzengrund, pointing to horizontal contamination. It is possible to conclude that both vertical and horizontal contaminations are important during the cycle of commercial egg production and contamination in rearing phase is higher than in growing and production phases.(AU)

O presente estudo foi desenvolvido com objetivo de detectar Salmonella sp. pelas técnicas de bacteriologia convencional e PCR em tempo real em amostras de forros de caixas de transporte (mecônio), de ambientes de criação (suabes de gaiola e de bebedouro), suabes de cloaca, ração e insetos oriundos das fases de cria, recria e produção de um lote de poedeiras comerciais. Foram coletadas 864 amostras das quais 248 foram originadas da cria, 392 da recria e 224 da produção. Das 864 amostras 2,8% foram positivas na técnica bacteriológica e 15,3% no PCR em tempo real. A contaminação aumentou da fase de cria para a recria e declinou na fase de produção. Vinte e quatro isolados de Salmonella foram tipificados como Salmonella Agona (41,7%), Salmonella Livingstone (33,3%), Salmonella Cerro (16,7%), Salmonella Senftenberg (4,2%) e Salmonella Schwarzengrund (4,2%). Na fase de cria identificou-se Salmonella Livingstone. Esses achados sugerem a contaminação vertical do lote. Nas fases de recria e produção os isolados pertenceram aos sorovares Agona, Cerro, Senftenberg e Schwarzengrund apontando para a contaminação horizontal. Pode-se concluir com este estudo que tanto a contaminação vertical como a horizontal são importantes no ciclo de produção de ovos comerciais e que a contaminação na fase de recria é maior que na fase de cria e de produção.(AU)

Package in the R environment for analysis of variance and complementary analyses / Pacote em ambiente R para análise de variância e análises complementares

The objective was to create a package in the R environment, called easyanova to provide functions for performing analysis of variance of qualitative treatments with several test options for mean contrasts and residual analysis. The package comprises the functions ea1(),ea2() and ec () and 19 data sets. The ea1() performs analyses in 13 designs and also the tests of Kruskal-Wallis and Friedman. The ea2() function performs analyses in experimental schemes with interaction (13 schemes). The ec() function tests mean group contrasts. The data and examples available in the package are associated mainly with animal research. Some of the possible analyzable designs are widely used in animal experimentation, such as Latin squares and split plot in time. In addition, the functions of the package are easy to use and make the necessary adjustments in cases of unbalanced experiments...

Objetivou-se criar pacote em ambiente R, denominado easyanova, a fim de disponibilizar funções para realizar análise de variância de tratamentos qualitativos, com várias opções de testes de contrastes de médias e análise de resíduos. O pacote dispõe das funções ea1(), ea2() e ec() e 19 conjuntos de dados. A função ea1() realiza análises em 13 delineamentos e também os testes de Kruskal-Wallis e Friedman. A função ea2() realiza análises em esquemas experimentais com interação (13 esquemas). A função ec() testa contrastes de grupos de médias. Os dados e exemplos disponíveis no pacote são voltados principalmente à experimentação animal. Entre delineamentos possíveis de serem analisados têm-se alguns muito utilizados na experimentação animal, como os quadrados latinos e parcelas subdivididas no tempo. As funções do pacote também são de fácil utilização e fazem ajustes necessários nos casos de experimentos desbalanceados...